PCR仪利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。
PCR仪的操作规程:
过去标准的PCR操作程序是将PCR仪必需反应成份分别加入一微量离心管中,然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下:
(1)向一微量离心管中依次加入
DNA模板 102-105拷贝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR缓冲液 1/10体积
ddH2O 补到终体积(终体积50μl-100μl)
混匀后,离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用,现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液,引物,ddH2O混合在一起,反应体积为20-25μl,只要试验人员加入处理好的样品就可以了。
(2)加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。
(3)冷至延伸温度时,加入1-5u Taq DNA聚合酶,离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。
(4)PCR仪的循环程序为:94℃变性30s,55℃退火20s,然后在72℃延伸30s,共循环30-35次。然后一次循环结束后,再将反应管置72℃温育5min,以确保充分延伸。