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基质金属蛋白酶(MMP-2)ELISA 试剂盒
双抗体夹心法是检测抗原常用的方法,操作步骤如下:
双抗体夹心法
一、将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。
二、加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
三、加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
四、加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步法检测。
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2)。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。
双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。
基质金属蛋白酶(MMP-2)ELISA 试剂盒
亲和素是一种糖蛋白,一分子亲和素可以与四个生物素小分子发生专一亲和作用,类似抗原与抗体亲和。它们之间的作用力是目前已知强的非共价作用。80年代后,随着生物素-亲合素系统(BAS)作用被发现,这一亲和作用被结合应用到ELISA技术上,大大提高了后者反应的灵敏性与专一性。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
操作程序
1. 分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入标准品50μl;在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品zui终稀释度为5倍)。每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。轻轻晃动混匀,37℃温育60分钟。
2. 弃去液体,甩干,每孔加满稀释后洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。如此重复5次,拍干。
3. 每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
4. 取出酶标板,每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
5. 测定:以空白孔调零,在450nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
6. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的,其实际浓度应该乘以总稀释倍数。
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